A 16. század közepére Kelet-Magyarországon és Erdélyben feszültség alakult ki a svájci reformátorokat és a Luthert követők között. Emellett az antitrinitarizmus (szentháromság-tagadás) megjelenése és a tanítások között egyre jobban kirajzolódó különbségek megkerülhetetlenné tették, hogy a különböző hitvallásokat elfogadó irányzatok követői saját szervezeti egységet alakítsanak ki.
A magyar református egyház megalakulása – ahogy a reformáció nyomán létrejövő más egyházaké is – egy évtizedeken át tartó folyamatos fejlődés eredménye volt. Ennek a folyamatnak kiemelkedő mérföldköve a magyar reformátusok számára az 1567. február 24-én és 26-án ülésező debreceni zsinat.
A gyűlésen részt vevő tiszántúli és tiszáninneni lelkészek egybehangzóan elítélték az antitrinitarizmust, illetve a II. Helvét Hitvallás elfogadásával megerősítették a kálvini irányzathoz tartozásukat. Megszülettek a magyar reformátusok első egyházi törvényei és meghatározták az istentiszteleti liturgiát is. Ennek hatására Tiszántúlon megszilárdult az első református egyházszervezet. Az itt megfogalmazott egyházi rendtartás szolgált alapul a következő évtizedek zsinatainak az egész Kárpát-medencében.
Melius Juhász Péter, a magyar reformáció meghatározó alakjának neve egybeforrt a debreceni zsinattal. Wittenbergi tanulmányai során ismerkedett meg a reformáció tanaival, majd onnan hazatérve az itthoni megújulás élére állt. Miután János Zsigmond erdélyi fejedelem az unitárius vallást választotta, s hatalmával mindent elkövetett, hogy valamennyi református antitrinitáriussá legyen, Melius megvédte Tiszántúlt és Debrecent, így az ott élők megmaradhattak a református hitben. Püspöki tisztsége tette lehetővé, hogy összeállítsa a debreceni zsinat által a szentháromságtagadókkal szemben elfogadott hittételek, valamint az egyházi szabálygyűjtemény szövegét.
A 16. század végére a magyar lakosság több, mint kétharmada reformátussá lett. Fokozatosan szétváltak a helvét és az ágostai hitvallású protestáns közösségek Felső-Magyarországon, Erdélyben, a török hódoltság területén, valamint a Dunántúlon is, és a felekezeti alapú gyülekezetek egyházmegyékbe, illetve egyházkerületekbe szerveződtek.
Bár a 16. században az egyházak még nem országos szinten szerveződtek, a protestáns egyházak a kezdetektől zsinatokon fogadták el hitvallásaikat és egyházi törvényeiket (kánon). Az évszázadok során kialakult a mai magyar református egyházak szervezeti felépítése: a legalapvetőbb és legkisebb egységek a helyi gyülekezetek (egyházközségek), melyeket a lelkészek, valamint a világi presbiterek (az élükön álló gondnokkal) vezetik. Az egyházközségek egyházmegyéket, azok pedig egyházkerületeket alkotnak. Az egyházmegyéket esperesek és egyházmegyei gondnokok vezetik, a kerületeket pedig püspökök és egyházkerületi főgondnokok irányítják. Az egyház életét érintő országos kérdéseket rendszeresen ülésező zsinat tárgyalja meg, melyet egy lelkészi és egy világi tagból álló elnökség irányít.